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養生片仔廣の肝腫瘍性病変(肝臓癌)の形成に対する抑制効果

これまでの研究の結果、「養生片仔廣」が虚血‐潅流モデルの肝細胞損傷や肝微小循環に強力な肝保護作用を有すること、肝実質細胞の金属誘発酸化ス トレスに強い抑制効果があることが確認されている。また、「養生片仔癀」は多くの漢方療法とは異なり、臨床研究で投与後2~3週間以内にほとんどのC型肝炎ウイルス感染に伴う慢性肝疾患患者のALT値が有意に低下することが報告されている。最近では、カナダの研究グループが、非アルコール性脂肪性肝炎患者 を対象とした臨床研究で生化学的、組織学的に「養生片仔廣」の治療効果を確認している。
本研究は、肝臓癌誘発物質(DEN)で肝癌を形成したラットを対象に「養生片仔廣」の肝臓癌形成の抑制効果について検討した結果、肝臓癌細胞の数、大きさ、容積は、「養生片仔廣」を投与することにより有意に減少することが本研究によって裏付けられた。
従って、「養生片仔廣」は肝臓癌形成を抑制し、漢方養生サプリメントとして大規模な応用の可能性を有すると結論付けることができる。
この研究はインターネットを利用したオンライン版の医学雑誌“Annals of Hepatology 2006;5(4):October-December:000-000”で報告されている。
研究者:マロタ;ハラダ;ゴ― KL;ロレンゼティ;ゲロサ;ミネリ
研究者メール:fmarchimede@libero.it

養生片仔廣(YHK)、実験誘発肝腫瘍性病変の初期段階に抑制効果

要旨:
本研究は、スプラーグ?ドーリー?ラットのジエチルニトロソアミン(DEN)誘発肝臓癌形成に対する漢方養生サプリメント養生片仔廣が効果を確かめることを目的 として実施した。ラットは無作為抽出により3群に分け、15週間にわたり追跡調査を行った。第1群には標準的食餌を与え、健康な対照群とした。第2、第3 群(ラット数はそれぞれ20匹)に対しては、DEN法を用いて肝前癌細胞巣を誘発した。しかし、第3群には同時に、1日当たり50mg/kgの養生片仔癀を投 与した。肝前癌細胞巣の定量的評価としては、免疫組織化学的染色及び画像解析を用いて胎盤型グルタチオン‐S-トランスフェラーゼP型(GST-P)陽性 細胞巣の測定を行った。DEN処置群は対照群と比べて有意の体重減少、肝重量の増加が認められた一方、DEN処置と同時に養生片仔廣を補助投与した群は、体重 減少、肝重量増加が抑えられた。DEN処置のみの群と比べると、YHK同時投与群のGST-P陽性細胞巣の数、大きさ、容積は有意に低値であった。さらに、養生片仔廣同時投与群では、肝臓癌の発生頻度、数、大きさ、容積が有意に抑えられた。養生片仔廣の抗酸化作用はいうまでもなく抗炎症性や抗線維化作用は、養生片仔廣の保護効果の説明に役立つと考えられるメカニズムである。従って、ラットのDEN誘発肝前癌病変の肝癌形成を抑制する漢方YHKは、漢方養生サプ リメントとして大規模な臨床応用の可能性を有すると結論付けることができる。

はじめに
今日、生体異物が癌形成に関与している可能性があるとの懸念が高まっており、ヒトおよびラット、ネズミなどの齧歯動物の両方を対象とした研究が確実な趨勢 となっている。確かに、DNAは発癌物質の体内吸収の全過程、最も感受性の高い組織への分布、更なるDNA反応型を生じる代謝発現、解毒、そして分泌と いった諸々のプロセスを通じて損傷を受ける可能性がある。環境中には、大グループの複素環アミン変異原物質を始めとして、数多くの遺伝毒性発癌物質が自然 発生している(1,2)。例えば、食品由来物質の一つである、2‐アミノ‐3、8‐ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノキサリン(MelQx)はラット肝 においてDNA付加体形成を誘発する能力を有し(3)、高用量の投与により明らかな肝臓癌が発生することもある(4)。臨床実験では、ヒトの1日の MelQx摂取量は被験者1人当たり0.2~2.6μgと推定され(5)、調理済みの食肉を食べた健康な被験志願者の尿からMelQxが検出され、定量化 できること(6~8)も判明している。しかし、何にも増して重要なことは、ヒトの腎臓や結腸組織にMelQx‐DNA付加体が発見されたという点である (9)。そうした発癌候補物質の検出?除去が最重要であることは言うまでもないが、癌形成予防効果のある食事によるアプローチが理想的な対策と言えるだろ う。実際、生体異物への恒常的な暴露に対する保護効果のある天然成分がいくつか推奨されているが、実験研究において有効性が認められた天然成分は数えるほ どしかない。著者らのこれまでのインビトロ、インビボ両実験研究においては、YHKが肝細胞損傷や虚血‐再潅流モデルの肝微小循環に強い保護効果を発揮す ること、(10,11)、養生片仔廣がインビトロで肝実質細胞の金属誘発酸化ストレスに強い保護制効果があることを示した(12)。実際、養生片仔廣は臨床研究で は、実験的に検査した多くのハーブ療法とは異なり、投与後2~3週間以内にほとんどのC型肝炎ウィルス感染に伴う慢性肝疾患患者のALT値が有意に低下 し、さらに、受賞パイロット研究ではマルヤマ?スコアが低下することも立証されている(13)。さらに最近では、別のカナダのグループが、非アルコール性 脂肪性肝炎患者を対象とした生化学的、組織学的研究の中で、養生片仔廣の治療効果を確かめている(14)。ラット肝は、癌イニシエーションやその後の発達の経 時変化すべてを研究するのに理想的なモデルである。なぜなら、種々の肝遺伝毒性発癌物質の投与後、数日もすれば、肝の単一細胞が胎盤型グルタチオン‐S‐ トランスフェラーゼ[単一胎盤型グルタチオンS-トランスフェラーゼ陽性(GST-P)細胞]を発現するからである(15、16)。そうしたGST-P単 一細胞とは別のある細胞群はGST-P細胞巣へと伸長し、腫瘍促進剤の投与により、一段とその数や大きさを増し、最終的にはGST-P腫瘍へと転換してい く。従って、GST-P単一細胞は「癌細胞の起始となるもの」と見なされ、GST-P細胞巣の数や大きさだけではなく、GST-P単一細胞の数も、その後 の癌リスクの定量的指標として用いることが可能である(15)。ただし肝GST-P陽性細胞巣のすべてが必ずしも腫瘍に発達するとは限らない。とはいえ、 肝GST-P陽性細胞巣と腫瘍との間には90%超の相関性があり、同種長期研究の分析では、肝臓癌の発生頻度との相関性も示されている(17)。こうし たことを前提として、本研究の目的は、化学的肝発癌の初期段階におけるYHKの抑制効果の可能性を確かめることである。

材料・方法
スプラーグ・ドーリー・ラットは環境(温度、換気、湿度、明暗サイクル)制御型飼育ケース内に収容し、12時間明/暗サイクル下温度23℃、湿度60%/10%で、イオン交換水と非栄養繊維を随時自由に摂れる条件下で飼育した。ラットは15週にわたり環境順応させた。
実験プロトコル 60匹のラットは無作為抽出によりそれぞれ20匹ずつ、3群に分け、実験終了時まで以下のような処置を施した。第1群は通常の固形飼料を食餌として与え、 健康な対照群とした。第2群には標準固形飼料を食餌として投与、また第3群には養生片仔廣(三七人参、杜仲、黄精、甘草、オタネニンジン、(株)協通事業、東 京、日本)を含有する標準固形飼料を食餌として与えた。なおYHKは1日摂取量を確実に50mg/kgとなるようにし、これら両群を肝癌形成モデルとし た。その後、多少の修正を加えた上でSoltおよび、Farber路油脂の報告(18)の記述に従い、両群のラットにジエチルニトロソアミン(DEN) (生理食塩水中200mg/kg/体重)を腹腔内へ単回投与した。標準飼料と粉末化YHKを適宜混合した食餌を毎日作製し、食事トレーは毎日チェックし、 ゴミを取り除き、重量を測り、食餌を補充するようにした。
組織病理学的分析及びグルタチオンS-トランスフェラーゼ胎盤型(GST-P)染色と計測 ラットは、15週にわたる研究期間終了時に屠殺し、外面的症状 を確認するために肉眼検査を実施した。ついで肝臓を切除して重量を計測した。ラットごとに、肝臓の両葉から5ミリ厚の切片を切り取り、直ちに冷却したアセ トン(0~4℃)で6時間かけて固定した。切片は、後に実施するGST-Pの免疫組織化学的検査のためパラフィン包埋した。GST-P細胞巣 (0.01mm2を超える面積の細胞病変として定義)は、Hsuらの報告(19)にあるとおり、ストレプトアビヂン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体 (ABC)を用いた免疫組織化学法により分析を行った。すなわち、キシレンで脱パラフィンし、過酸化水素で冷却し、正常血清でブロックした後、肝組織切片 はヤギ正常血清、抗ウサギGST-P抗体(1:2000)、ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG(1:400)、そして最後にABCにより順次処置した。ペル オキシダーゼ結合部位を示すために、ジアミノベンジジン法(20)を用いた。病変の定量的評価としては、他の報告(21,22)に記載されていたように、 画像解析システムを用いて、平方センチ当たりのGST-P陽性細胞巣の数、細胞巣が占める切片面積のパーセント比、およびGST-P陽性細胞巣や小結節の 直径(>0.2mm)とした。肝病変はSquireとLevittの報告(23)に記載された基準、並びに米国実験動物研究会のガイドライン(24)に 則って作成した解説書に従い記述に従い診断を行った。

統計分析
結果は中央値±標準偏差として表した。統計分析はウインドウズXPのSPSSプログラムを使用して実施した。各グループ間の格差は一元配置分散分析を用い て評価し、その後、Dunnettesの対比較検定並びにTukeyの群間誤差率による評価を行った。いずれの場合も、p<0.05が統計的有意の最低水 準と考えられた。

結果
体重と肝重量
ラットはいずれも、屠殺を予定していた時点まで良好な状態のまま生存した。DEN処置を施した群は、対照群に比べて有意に体重が減少し、肝重量は増加した(p<0.05)(表I)。YHK経口投与群では、DEN誘発の体重減少や肝重量増加が抑えられた(p<0.05)。

GST陽性細肝胞巣の評価
GST陽性細胞巣の頻度についての定量分析の結果を表IIにまとめた。二次元評価では、GST陽性病変は、養生片仔廣を投与した第3群のほうが第2群より有意 に少なかった(図1)。立方センチ当たりの病変数、平均容積、肝実質に占めるGST陽性病変のパーセント比率として表した場合の容積などの容積評価、統計 分析を適用した場合にも、まったく同じ結果が得られた。
腫瘍発生頻度 未処置群のラットでは肝腫瘍は検出されなかったが、DEN処置群のラット(第2、第3群)では、肝細胞原発の腫瘍が認められた。第3群の癌 発生頻度は第2群のそれと比べ有意に低かった(p<0.01)。また、癌の多重度と腫瘍合計を、容積計測により評価した場合も、第2群より第3群のほうが 有意に低かった(p<0.05)。

表 I
DEN誘発肝癌形成時における体重と肝重量の変化:YHK同時投与の効果
処置 体重 肝重量
    研究開始時 研究終了時 グラム
1 標準的飼料のみ 127 ± 1 353 ± 9 14.7 ± 0.5
2 DEN処置 125 ± 2 321 ± 5 * 16.9 ± 0.5 *
3 EN処置+YHK 50mg/kg/日投与 126 ± 1 349 ± 8 § 15.0 ± 0.6 §

* p < 0.05 対養生片仔廣同時投与群及び対健康な対照群
§ p < 0.05 対DEN処置のみのラット
表 II
DEN誘発肝癌形成における肝GST-P陽性病変の数と大きさ:YHK同時投与の効果
2 DEN処置 3 DE処置+ YHK 50mg/kg/日
個数/cm2 12 ± 4 6 ± 3 *
平均面積 (mm2) 0.32 ± 0.04 0.25 ± 0.03 *
数/cm3 2,012 ± 133 1,545 ± 109 *
平均容積 (mm3) 0.17 ± 0.03 0.14 ± 0.02 *
細胞巣/肝実質 % 28.2 ± 2.5 21.7 ± 2.1 *

* p < 0.05 対 DEN処理のみのラット
表 III
DEN誘発肝細胞癌の発生頻度、数、大きさおよび容積:養生片仔廣同時投与の効果
2 DEN処置 3 DE処置+ YHK 50mg/kg/日
    投与
HCCラットの数 (%) 96 ± 4 71 ± 4
平均面積 (mm2) 1.40 ± 0.47 0.17 ± 0.09 *
数/cm3 1.3 ± 0.3 0.8 ± 0.2 *
平均容積 (mm3) 0.79 ± 0.28 0.02 ± 0.01 *
HCC/肝実質 % 0.7 ± 0.2 0.2 ± 0.1 *

*p < 0.01 対 DEN処理のみのラット

図 1 DEN誘発肝病変のGST-P陽性染色(x400)。標準飼料投与群では、大量の陽性細胞巣が群れをなした状態にあるのが見えるが、YHK同時投与群では、点在する細胞巣の数が際立って少なく、染色強度は弱い。

考察
肝細胞癌(HCC)は破壊的な影響をもたらす疾患であり、ますます一般的になりつつある。この癌の疾患管理の進歩が遅々としており、また再発率の高いこと が、依然として手術による患部切除の成功を妨げる大きな要因となっている(25)。C型肝炎およびB型肝炎ウィルス、一部の地域ではアフラトキシンが HCCの主な原因であるが、生体異物が癌形成により広範に関わっていることに対して一段と懸念が高まっている。
実際、環境中には、大グループの複素環アミ ン突然変異原など、数多くの遺伝毒性発癌物質が自然に発生している(1,2)。遺伝毒性発癌物質は初代細胞のDNAに不可逆性の損傷を与え、それが促進物 質の存在下で、自律増殖能を獲得するまで成長するところから、最近では実験的にそうした状況を作り出すために数多くの科学物質が使用されている。
肝化学発癌は、イニシエーション(起始)、プロモーション(促進)、プログレッション(進行)の少なくとも三段階からなる多段階プロセスからなると考えられてお り、各段階それぞれに宿主生化学的、内分泌学的、免疫学的、ミクロレベルの環境的制御システムが関与している。
実際、DNAは、発癌物質の体内吸収から、 感受性の最も高い組織への分布、更なるDNA反応型を生じる代謝、解毒、排泄に至るプロセス全体を通じて損傷を受ける可能性がある。癌を含め、多くの疾患 の予防には食事が大きな役割を果たしていることは確たる証拠があることから考えると、この場合、食事による予防的アプローチを取ることが理想的な戦略とい えるだろう(26)。こうしたことを受けて、今日では、1980年代初頭に日本で「機能性食品」と名づけられた特定栄養食品の効用を裏付ける論文が数多く 見られるようになっている。
著者らの本研究では、漢方養生サプリメント養生片仔廣を使用した。養生片仔廣はいくつかの肝損傷実験モデルにおいて強力な肝保護性を有 することが立証されている(10~12)。しかし、ヒトへの臨床試験に適用できない、あるいは時に重篤な有害事象を引き起こすことが知られ (27,28)、長期投与には安全でないとされる(29)他の天然治療薬とは異なり、養生片仔癀は通常の食事に安全に組み入れることが可能で、長期研究では、 HCV関連肝硬変患者(13)や、直近では、非アルコール性脂肪性肝炎患者(14)のトランスアミナーゼ値を有意に低下させる効果があることが証明されて いる。
本研究ではYHKを肝有害化学物質とともに経口投与した場合、GST-P実験からも明らかなように、癌形成の初期段階を抑制する効果のあることが裏 付けられた。GST-Pは、ラットの肝癌形成を通じて、蛋白質レベルだけではなく、mRNAレベルにおいても、持続性前腫瘍性細胞や腫瘍性細胞を検出でき る安定したマーカーである(30,31)。全体としてGST類は、疎水性分子の細胞内移動と有毒物質の代謝の両面に重要な役割を果たしている二量体蛋白質 系統群(α、μ、π、θ、Σ、κ、ζとして表示)である(32)。ラットの正常な肝臓ではGST-P蛋白質が検出されることは滅多にないが、過形成性結節 や肝細胞癌においては、用いる発癌物質の種類と関係なく発現し、検出されるようになる。GST陽性細胞は通常、DNA複製の亢進とGST-P陽性単一細胞 の増殖によって特徴づけられる、肝GST-P陽性細胞巣は、そうしたDNAの複製と、細胞死によって決まるその平衡力との間で生じた結果と考えられている (33,34)。
しかし、上述の通り、多くの化学有毒物質及び/または食物由来の有毒物質は、進行性の細胞損傷を誘発する腫瘍促進剤として作用することも 考えられる。こうした意味において、非常に興味深いのがMatsuiらによるデータで、それらは、HCC手術後の予後の改善に機能性食品によるアプローチ がもつ有益な効果を示している(35)。このことにより、そうした複合的な問題に取り組むためには十分な計画の下での研究が必要があることを強調する思慮 深い論評が生まれた(36)。
特に、本研究はGST-P陽性細胞巣と明らかなHCCの数、大きさ、容積が、養生片仔廣を同時投与することにより有意に減少する ことが。特に後者の、有意差は前者よりも高いことを示した。一般に、化学予防剤の効果、脂質過酸化反応もしくはDNA付加体形成の抑制、それらの間に存在 するI相もしくはII相酵素の調節には幾多のメカニズムが関わっている。著者らは、先般、養生片仔廣が、I相およびII相発癌物質代謝酵素の調節はいうまでも なく、肝実質細胞やリソソーム分画を金属誘発酸化ストレスから有意に保護する作用を持つ可能性があることを立証した(12)(Marotta他。私的データ、論文作成中)。
養生片仔廣が肝臓癌形成を有意に抑制するメカニズムについては、今のところ解明されてはいない。しかし、すべてを勘案すると、養生片仔廣は、杜仲 や三七人参など、強力な抗酸化性/抗炎症性のある成分(37,38)や、没食子酸や甘草など、抗増殖性やアポトーシス促進性効果を発揮する成分に富んでお り(39,40)、これらが養生片仔廣の前癌病変形成阻害効果を説明するために役立つと考えられている。一方、慢性肝疾患のHCCへの転換を上手に抑制できる 方法を模索するにあたり、養生片仔廣はその安全性から、大規模臨床応用が可能な機能食品としての可能性を有している(41)。「数多くの自称保護活性天然成 分」にあがっている予防効果のある天然成分の多くが、癌形成プロセスを悪化させないまでも(44,45)、養生片仔廣と同様の効果を発揮できずにいることを考 えると(42,43)、これは大変興味深いことである。

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      みの方
    70代 / 女性
    肝硬変の状態が、10-13年位続いて います。癌にならない為にどんなこ とでもしたい心境です。養生片仔廣 を飲みだして2年になりますが、G PTが下がってうれしく思います。 もっと早く養生片仔廣に出会いって いればよかったと思います。
    60代 / 男性
    ガンの手術をして8年過ぎました。 いろいろな時はありましたが再発も なく過ごして来たのは養生片仔廣の お陰と信じております。
    ウルソは飲まなくでも養生片仔廣は 忘れてはいけないと思います。手術 後こんなに生きていられるとは思っ てもいませんでした。
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